产品货号：
WH0208
中文名称：
DNA片段化/末端修复/加dA尾试剂（Illumina)
英文名称：
Fragmentation/End repair/dA-tailing Reagent（Illumina)
产品规格：
24次|96次
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本制品是专门针对于illumina高通量测序平台所优化的预混酶模块，包含了DNA片段化、末端修复以及3'端dA尾添加所需的所有酶类，可将双链DNA片段化为小片段，并分别在片段化DNA两端添加5'-P和3'端dA，所得产物无需纯化，可直接通过Fast Ligation Reagent（货号：WH0201）用于adapter的连接。该模块采用一步法的反应流程，省去了多步纯化步骤，可对微量DNA样本进行高效、快速的片段化、末端修复及dA尾添加，操作更加简便，文库转化效率更高。
保存：-20℃，避免反复冻融，有效期一年。
（请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项）
一、试验准备
二、试验步骤
附录I：DNA样品溶液中二价盐离子以及EDTA的去除
推荐使用BalbSeq Size Selection DNA Beads（货号：WH0199）进行样本纯化。
附录II：优化片段化处理时间
片段化反应时间需要根据DNA上样量进行优化，参考图1所示曲线选择反应时间。优化过程请使用将实际用于测序的DNA样品，这将有助于在测序时保证片段化过程的可重复性。初次优化时，我们推荐添加2个额外的反应时间，即依据图中曲线选择反应时间后，在此时间基础上分别延长和缩短3min。若对片段大小有较精确的要求，可在此基础上继续对反应时间进行微调。在实际操作中，若DNA上样量≥100ng，用户可在片段化步骤完成后即对反应效果进行评价。具体方法为使用1.8倍体积BalbSeq Size Selection DNA Beads（货号：WH0199）对反应产物进行纯化，并将其溶解于10μL Tris溶液或去离子水。然后使用Bioanalyzer High Sensitivity试剂盒确定片段分布。
对于上样量＜10ng的片段化反应，为了节省反应时间，我们推荐在每个反应体系中（50μL）添加2.5μL的FEA Enhancer。反应时间则推荐使用图1中将10ng DNA切割至特定片段大小所需时间的一半。例如：若期望DNA片段集中于350bp，则加入FEA Enhancer后反应8min左右即可。
图1不同DNA上样量经片段化后产出片段大小与反应时间对应曲线
附录III：1×TE溶液中DNA的片段化/末端修复/A尾添加
当DNA溶解于1×TE溶液中时，请参照以下步骤进行DNA的片段化/末端修复/A尾添加反应。
相关搜索：DNA片段化/末端修复/加dA尾试剂（Illumina)
- 用于双链DNA的片段化、末端修复及3'端添加dA，适用于illumina高通量测序平台DNA文库构建。
- 适用样本量：1ng～1μg DNA。
- 单管酶促反应，一步完成双链DNA的片段化、末端修复、dA添加反应。
- 高文库转化效率，DNA样本起始量可低至1ng。
| 组分 | 24次 | 96次 |
| 5×FEA Enzyme Mix | 240μL | 960μL |
| 10×FEA Reaction Buffer | 120μL | 480μL |
| FEA Enhance | 120μL | 480μL |
| Nuclease-Free ddH2O | 1mL | 4×1mL |
保存：-20℃，避免反复冻融，有效期一年。
（请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项）
- 操作过程请注意避免核酸样品和产物之间的交叉污染。
- 请使用不含RNA酶或DNA酶的枪头、EP管进行试验。
- 试验开始前，请清洁操作台，并使用RNA酶及DNA酶清除试剂，如RNase Away处理台面。确保没有RNA酶和DNA的污染。
- 进行文库扩增前，请确保PCR仪已经调试好并处于稳定的状态。
- 试验前请仔细阅读说明书，如果需要暂停试验，或者无需立即进行下游试验。可根据说明书推荐将试验产物保存于-20℃并安排后续试验。
- 由于使用本品所进行的片段化过程为酶促反应，故片段化过程对反应温度、反应时间、体系配制以及DNA上样量等因素较为敏感。强烈推荐用户按照本说明书所述步骤及优化的反应参数（如反应时间等）进行试验。
- BalbSeq Fast Ligation Reagent（货号：WH0201）
- BalbSeq NGS Library Amplification Reagent（货号：WH0210）
- BalbSeq Single-Index Adapter（Illumina)（货号：WH0206）
- BalbSeq Size Selection DNA Beads（货号：WH0199）
一、试验准备
- 在开始实验前，明确核酸的浓度及纯度至关重要，推荐上样量1ng～1μg DNA。DNA需溶解于以下溶液中：去离子水、10mM Tris、Buffer EB或LoTE（0.1×TE）等。
注意：- 确定上样DNA浓度至关重要，尤其在上样量低于100ng时。推荐使用Qubit、Picogreen或者其他染料法对DNA浓度进行准确定量。
- 请确认DNA溶液中不含阳离子及螯合剂。如果DNA溶解于1×TE或不确定DNA溶液中的EDTA浓度，请参照附录Ⅰ所述步骤，使用BalbSeq Size Selection DNA Beads（货号：WH0199）进行纯化或参照附录Ⅲ进行片段化处理。
- 确定上样DNA浓度至关重要，尤其在上样量低于100ng时。推荐使用Qubit、Picogreen或者其他染料法对DNA浓度进行准确定量。
- 将各试剂置于冰上，5×FEA Enzyme Mix融化后用手指后轻弹混匀，不要涡旋。其余试剂可短暂涡旋混匀。
二、试验步骤
- 照下表设置PCR仪反应程序。开启热盖，热盖温度设置为70℃。
操作步骤 温度 时间 1 4℃ 1min 2 32℃ 3～24min* 3 65℃ 30min 4 4℃ 保持
注*：确切的片段化反应时间需要根据DNA的实际上样量进行优化。下表1中列出10ng、100ng和1000ng上样量DNA片段化所需的时间，用户可以依据此时间进行调整。调整过程中，我们推荐额外设置一个反应时间延长3min以及一个缩短3min的对照。这样有助于确定切割至所需片段大小时所需要的准确反应时间。关于片段化时长的更多建议，请参考附录II。
表1：片段化时间选择表（32℃)DNA主峰大小 250bp 350bp 450bp 550bp 10ng DNA上样量 24min 16min 14min 10min 100ng DNA上样量 16min 10min 8min 6min 1000ng DNA上样量 14min 8min 6min 4min - 请按下表配制反应体系，冰上操作，各组分加入后，请轻柔吸打混匀，注意不要涡旋。
- 当DNA上样量≥10ng
成分 用量 10×FEA Reaction Buffer 5μL DNA样本 X μl Nuclease-Free ddH2O （35-X) μL 总体积 40μL - 当DNA上样量＜10ng
成分 用量 10×FEA Reaction Buffer 5μL DNA样本 X μl FEA Enhancer 2.5μL Nuclease-Free ddH2O （32.5-X) μL 总体积 40μL
注：对于多个反应，请计算所需试剂的总体系并在此基础上增加体系10%，以避免因溶液转移过程中挂壁损失而造成分装反应数不足的问题。 - 当DNA上样量≥10ng
- 取1个新的200μL薄壁管置冰上，向管中加入10μL 5×FEA enzyme Mix，随后将步骤2中反应体系转移40μL至同一薄壁管中，轻柔吸打混匀6～8次。
- 瞬时离心薄壁管，立刻置于已预冷至4℃的PCR仪中，并启动反应程序。
- 当反应程序结束后，将薄壁管从PCR仪中取出并置冰上。
- 立即进入接头连接步骤，为保证连接效率，推荐使用BalbSeq Fast Ligation Reagent（货号：WH0201）。
附录I：DNA样品溶液中二价盐离子以及EDTA的去除
推荐使用BalbSeq Size Selection DNA Beads（货号：WH0199）进行样本纯化。
- 将磁珠置于室温平衡20min。
- 若DNA溶液体积小于50μL，请用无核酸酶的去离子水补足体积至50μL。
- 加入1.8×体积（90μL）完全涡旋混匀的磁珠至DNA溶液中，吸打混匀10次。若DNA溶液体积大于50μL，请根据DNA溶液的实际体积，加入1.8×体积完全涡旋混匀的磁珠。
- 室温孵育5min后，将反应管置于磁力架上5min。待磁珠完全贴壁后，用移液器小心吸弃上清。
- 将反应管置于磁力架上，用200～500μL（没过磁珠即可） 80%乙醇（现用现配）洗涤磁珠，用移液器轻轻吹打3～5次（不要吹散磁珠）。磁力架上静置30sec后，用移液器小心吸弃上清。
- 重复此洗涤步骤一次。
- 将反应管置于磁力架上，打开离心管盖于室温条件下晾置5～10min或至磁珠干燥为止。
- 将PCR管从磁力架中取出，加入32.5μL 10mM Tris-HCl（pH8.0）进行洗脱，使用移液器吹打充分混匀10次。室温静置5min后，置于磁力架上5min，待磁珠完全贴壁后，转移约30μL上清至新的离心管中。
- 使用Quibit、Picogreen或其他荧光定量方法测定纯化后的DNA浓度。
附录II：优化片段化处理时间
片段化反应时间需要根据DNA上样量进行优化，参考图1所示曲线选择反应时间。优化过程请使用将实际用于测序的DNA样品，这将有助于在测序时保证片段化过程的可重复性。初次优化时，我们推荐添加2个额外的反应时间，即依据图中曲线选择反应时间后，在此时间基础上分别延长和缩短3min。若对片段大小有较精确的要求，可在此基础上继续对反应时间进行微调。在实际操作中，若DNA上样量≥100ng，用户可在片段化步骤完成后即对反应效果进行评价。具体方法为使用1.8倍体积BalbSeq Size Selection DNA Beads（货号：WH0199）对反应产物进行纯化，并将其溶解于10μL Tris溶液或去离子水。然后使用Bioanalyzer High Sensitivity试剂盒确定片段分布。
对于上样量＜10ng的片段化反应，为了节省反应时间，我们推荐在每个反应体系中（50μL）添加2.5μL的FEA Enhancer。反应时间则推荐使用图1中将10ng DNA切割至特定片段大小所需时间的一半。例如：若期望DNA片段集中于350bp，则加入FEA Enhancer后反应8min左右即可。
图1不同DNA上样量经片段化后产出片段大小与反应时间对应曲线
附录III：1×TE溶液中DNA的片段化/末端修复/A尾添加
当DNA溶解于1×TE溶液中时，请参照以下步骤进行DNA的片段化/末端修复/A尾添加反应。
- 按照下表设置PCR仪反应程序。请确认在反应中开启热盖。如有可能，请将热盖温度设置为70℃。
反应步骤 反应温度 反应时间 1 4℃ 1min 2 32℃ 5～35min* 3 65℃ 30min 4 4℃ 保持
注*：反应时间需根据DNA的实际上样量进行优化。若DNA上样量≥10ng，反应体系中加入2.5μL FEA Enhancer，推荐使用25min作为起始反应时间，此时产生的片段主要集中于300～500bp；若DNA上样量＜10ng，反应体系中加入5μL FEA Enhancer，则推荐使用15min作为起始时间，此时片段集中于300bp。若需要进行调整，则请以3min为单位，在原反应时间基础上进行增减，直至得到所需要的片段大小。 - 请按下表配制反应体系，冰上操作，各组分加入后，请轻柔吸打混匀，注意不要涡旋。
- 当DNA上样量≥10ng
成分 用量 10×FEA Reaction Buffer 5μL DNA样本 X μl FEA Enhancer 2.5μL Nuclease-Free ddH2O （32.5-X) μL 总体积 40μL - 当DNA上样量＜10ng
成分 用量 10×FEA Reaction Buffer 5μL DNA溶液 X μl FEA Enhancer 5μL Nuclease-Free ddH2O （30-X) μL 总体积 40μL
注：对于多个反应，请计算所需试剂的总体系并在此基础上增加体系10%，以避免因溶液转移过程中挂壁损失而造成分装反应数不足的问题。 - 当DNA上样量≥10ng
- 取1个新的200μL薄壁管置于冰上，向管中加入10μL 5×FEA enzyme Mix，随后将步骤2中反应体系转移40μL至同一薄壁管中，轻柔吸打混匀10次。
- 瞬时离心薄壁管，立刻置于已预冷至4℃的PCR仪中，并启动反应程序。
- 当反应程序结束后，将薄壁管从PCR仪中取出并置于冰上。
- 立即进入接头连接步骤，为保证连接效率，推荐使用BalbSeq Fast Ligation Module（货号：WH0201）。
相关搜索：DNA片段化/末端修复/加dA尾试剂（Illumina)